Přední německá společnost ibidi, dodavatel pokročilé technologie pro buněčnou mikroskopii, nabízí jedinečnou možnost bezplatného vyzkoušení až 3 produktů prostřednictvím

ibidi Free Sample Program

X-Clarity - polymerizační jednotka, elektroforézní cela a řídící jendotka s chlazením 

Jak funguje X-Clarity?

Oproti studiu jednotlivých buněk je mikroskopické studium orgánů náročnější kvůli tloušťce vzorku a jejich neprůhlednosti. Za neprůhlednost je zodpovědná zejména fosfolipidová buněčná membrána, která kvůli rozdílnému indexu lomu od okolního vodního prostředí způsobuje rozptyl světla. Druhou komplikaci, kterou membrána způsobuje je její neprostupnost pro fluorescentně označené molekuly- protilátky či nukleové kyseliny pro imunoznačení respektive in-situ hybridizaci.

Pro přípravu orgánů je nejprve třeba zbavit organismus, napříklald aboratorní myš, krve perfuzí s PBS. Po vymytí krevních komponentů se tkáň po dobu 24h fixuje 4% roztokem PFA při teplotě 4oC. Formaldehyd zafixuje proteiny umožní jejich navázání na polyakrylamidovou hydrogelovou mřížku, která se vytvoří v následujícím kroku.  V přístroji X-Clarity se nejprve vzorek tkáně napustí monomerem akrylamidu, který posléze polymerizuje ve vakuovém inkubátoru za 37oC  bez přístupu kyslíku, který by proces inhiboval.  (Ukázka videa dole)

V dalším kroku se vzorek tkáně umístí do kazety vhodné velikosti, která umožní kontinuální promývání vzorků roztokem SDS a tok proudu při elektroforéze. Kazeta se vzorkem se vloží do cely, ve které je udržována konstantní teplota, aby se zabránilo poškození vzorku.

Ukázka orgánu v různých stádiích přípravy. Před a po elektroforéze a po ekvilibraci s roztokem s kompatibilním indexem lomu.

Právě proces elektroforézy, byl nejkritičtější a nejvíce komplikovaný krok na optimalizaci během Diessenrothova experimentu. Díky optimalizovanému promývacímu pufru pro X-Clarity se o tento krok nemusíte obávat. Kontrolní jednotka se stará o pumpování pufru i dodatečné chlazení a kontrolu proudu a napětí. Molekuly SDS tvoří v kapalině micely, které šetrně zachycují lipidy a nefixované proteiny, a ty jsou vlivem elektrického pole transportovány skrz vzorek a odnášeny v toku elektrolytu. V závislosti na velikosti a typu vzorku trvá jeho promývání od 2 hodin jako v případě myšího střeva až po 20h v případě celého myšího srdce.  

Záznam průběhu experimentu s konstatntí hodnotou proudu.   

Po promytí se vzorek promyje PBS  a je připraven k imunoznačení  a posléze ustavení indexu lomu. Jelikož hydrogelová síť a navázané proteiny mají vyšší index lomu než vodní prostředí, pro eliminaci rozptylu světla při přechodu mezi různými prostředími se PBS nahradí kapalinou se stejným indexem lomu tedy 1,46.

X-Clarity II - inovovaná jednotka

V této kapalině je vzorek možné i pozorovat a uchovávat. Vhodné techniky na pozorování 3D struktury vzorku jsou konfokální, dvoufotonová nebo light-sheet mikroskopie.

Pohled do myšího mozku- stěny cév žlutě a ECM červeně

Proč pracovat s X-Clarity?

1. Práce s celým orgánem na rozdíl od tenkých řezů nepoškodí strukturu vzorku
2. Je možní pozorovat celulární uskupení a spoje i na dlouhé vzdálenosti, například u neuronů.
3. Po molekulární fenotypizaci imunoznačením je možné pomoci EF protilátky opět odstranit a proces opakovat s jinými látkami
4. Díky X-Clarity je proces vždy precizně kontrolován a je tak reprodukovatelný

Design inverzního mikroskopu je velmi elegantní, ale jeho konstrukce je uzpůsobena na pozorování očima. Oči jsou všestranné nástroje, leč mají své nedostatky = jeden expoziční čas a dlouhou adaptaci na tmu. Samozřejmě nejsou schopny pořizovat záznam v publikační kvalitě.

Když nahradíte oči citlivou CMOS kamerou a obraz promítáte na monitor, můžete pracovat i ve světlé místnosti a zachytíte i slabý fluorescenční signál a když už oko vyřadíte z rovnice, můžete změnit design celého přístroje. To přesně učinili inženýři ze společnosti Logos a místo mikroskopu stvořili digitální zobrazovací přístroj (digital imaging system).

Design Celena S vychází z inverzního uspořádání. Mikroskop má manuální stolek pro posun vzorků a lze vybavit různými adaptéry, na běžná sklíčka, vícekomorové kultivační destičky, nebo on stage inkubátory od společnosti Ibidi.

Kolečkem v přední části se manuálně vybere z až pěti objektivů od japonského OEM. Kvalita vybraných objektivů je závislá na vašem rozpočtu, ale vyberete si od Plan-Achromatických přes Fluoritové až po Plan-Apo, od zvětšení 1,25x po 100x.

Velkou výhodu skýtá také elektronické ostření, které se dá ovládat ručně přes koncentrické knoflíky na jemné a hrubé ostření, nebo přes ovládací software. Díky parfokálníu nastavení objektivů máte vzorky zaostřené i při přepnutí objektivů a díky imaged based autofocus a paměti pro několik pozic ohnishové roviny (focal plane) budou snímky ostré bez vaší námahy a ve správně rovině vzorku. Elektronické ostření, respektive posun v Z ose, vám také umožní tvorbu Z-stacku, což pomůže například pro zobrazení tvaru buněk nebo organoidů.

I když Celena S funguje ve světlém poli a fázovém kontrastu, nejvíce síly ukáže při použití fluorescence. Levá strana skrývá táhlo, kterým lze měnit kostky vybavené excitačním LES světlem a filtry optimalizovanými pro specifická barviva. Díky třem pozicím hravě vytvoříte tříkanalové barevné fotky. Filtrové kostky lze měnit za různé druhy, mezi které patří modrá DAPI, EGFP, nebo mCherry. Základní sestava umožňuje vybrat si z 12ti filtrů, ale je možné dodat i filtr na zakázku přesně pro vaši aplikaci.

S Celenou S pořídíte krásné snímky jak fixovaných tak i živých buněk.  Díky 16-bitové sCMOS kameře s rozlišením 1.3 Mpix (1280x1024) docílíte kvalitních snímků s nízkou hodnotou šumu i během krátké expozice, která lze manuálně nastavit od 10ms do 10s. Mimo expozici nastavíte i zisk (gain) vždy tak, abyste využili celý dynamický rozsah senzoru od černé až po bílou, tedy v 65536 odstínech šedi. V případě, že se vyskytne saturace, budete na ni upozorněni softwarem a pak snadno upravit parametry.

Díky solid state LED zdrojům světla, které jsou součástí každé kostky máte:

• Životnost desítky tisíc hodin
• Stabilitu jasu
• Okamžitou použitelnost = žádné zahřívání
• Rychlé zapínání a vypínání světla bez mechanické závěrky, tudíž spolehlivost a minimum fototoxicity nebo fotobleachingu

Kostky, se dají měnit po odstranění 4 šroubů krycí desky a zvládne to po krátkém zaškolení každý.

Software

Bez správného softwaru je i nejlepší hardware bezcenný. Celena S je vybavena softwarem na pořizování a základní editaci snímků které uložíte na 128Gb SSD disk. Přístroj nevyžaduje externí PC a je tak ihned po zapnutí připraven na pořizování snímků.  Horní lišta vám dovolí vybrat ze základních módů: Capture, Z-stack, Time Lapse, Cell Counter a File manager. Panel na pravé straně zobrazí relevantní údaje o tom, který používáte objektiv, filtr, expoziční čas, polohu ohniskové roviny atd.

Je Celena S pro mě?

Je na vás, který mód vyberete a jaké buňky nebo vzorky do Celeny S vložíte.  Pokud děláte rutinní práci s fluorescencí a váš běžný mikroskop je vytížen, nemáte rozpočet na přístroj klasické konstrukce, nebo chcete pouze jít s dobou, zkuste se zamyslet nad pořízením Celena S. Jestli váháte, v KRD vám rádi poradíme.

Optimalizované protokoly.

RBC vyvinula a optimalizovala postupy tak, abyste docílili zaručeného výsledku, ať je váš zájem o DNA z krve či tkáně, z bakterií či rostlinných buněk nebo klidně totalRNA. Celkem je k dispozici 19 kitů.

DNA a magnet - jak to funguje?

Patentovaný proces izolace DNA se odehrává ve 14-ti pozičních zkumavkových stripech, podobných, jaké znáte například z PCR.  Deset zkumavek s reagenciemi je zakryto ochrannou fólií, která je perforována speciálním hrotem před přidáním vzorku automatickou pipetou. Riziko křížové kontaminace je tak minimalizováno na rozdíl od kitů se zásobními lahvičkami. Dvě ze zbývajících čtyř zkumavek slouží k ohřevu vzorku a další dvě k oplachu vzorků.

Stripy obsahují reagencie, tak jak znáte z běžné procedury, které odstraní kontaminující látky jako proteiny a lipidy. Nukleové kyseliny z lyzátu se během inkubace navážou na speciální magnetitové částice pokryté celulózou a silný magnet přitáhne částice ze suspenze ke stěně zkumavky. Kulatý design promývací zkumavky způsobí vířívé proudění, a kontaminanty jsou tak efektivně omyty.

Automatické extrakce a atraktivní design.

Pokud pracujete s mnoha vzorky, největším potěšením pro vás bude, že celý proces je automatizovaný. Do UV dekontaminované komory vložíte stripy s napipetovanými vzorky a spustíte příslušný program.  Automatické pipety, zahřívané bloky a magnet za vás udělají zbytek. Vybrat si můžete ze tří modelů, které se liší počtem jak zpracovaných vzorků tak chytrými přídavnými moduly které zvýší pohodlí a spolehlivost práce. Jedná se o spektrofotometr, který automaticky změří Abs260/280, tedy čistotu nukleové kyseliny, nebo skener čárového kódu, který zajistí dohledatelnost vašich vzorků. Společným jmenovatelem všech modelů je atraktivní design s typickým svítícím nápisem MagCore, který zapůsobí na každého nového člena vašeho týmu nebo návštěvníka vaší laboratoře.

Cost-effective + konzistentní = oblíbený

Automatizací rutinních části výzkumu nebo analýz ušetříte obrovské množství cenného času a hlavně zajistíte konzistenci. Při opakovaných procedurách se tak zabrání lidské chybě a nesrovnalostem v datech. Tímto vám přístroje s kity MagCore zajistí hladký průběh práce a v konečném důsledku ušetří peníze. Naši klienti to vědí a proto již více než 30 laboratoří v České Republice a na Slovensku s přístroji pravidelně pracuje a provedlo již stovky tisíc izolací. Nečekejte na nic a staňte se dalším! 

• koncentrace glukózy 
• teploty
• aktivity
• respirace
• tlaků : arteriální, pleurální, venózní, levý ventrikulární, okulární a měchýřní
• biopotenciálů (EKG, EEG, EMG, EOG) 

• Studium spánku

• Studium záchvatů

• Náladové poruchy

• Pohybové poruchy

• Neurodegenerativní poruchy